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項(xiàng)目名稱(chēng)： 醫(yī)學(xué)分子診斷新技術(shù)的研究
推薦單位： 寧波市
項(xiàng)目簡(jiǎn)介： 1. 科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域：本項(xiàng)目屬基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)類(lèi)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域。
2. 主要內(nèi)容：（1）在國(guó)際上首次聯(lián)用免疫磁珠陽(yáng)性和陰性篩選及定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，建立了外周血中微量消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞檢測(cè)及判斷其臨床意義的醫(yī)學(xué)分子診斷新技術(shù)。（2）以癌胚抗原（CEA）mRNA作為分子標(biāo)志，采用免疫磁珠/RT-PCR技術(shù)檢測(cè)胃癌患者外周血中的癌細(xì)胞，分析了其陽(yáng)性檢出率與病期的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)早期患者也有25%的陽(yáng)性率；在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)CEA mRNA的檢出率與Dukes 分期呈正相關(guān)。（3）結(jié)腸癌患者外周血細(xì)胞角蛋白20（CK20） mRNA 的檢出率與腫瘤大小、淋巴結(jié)及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)。（4）通過(guò)對(duì)肝癌、肝硬化和肝炎患者外周血中甲胎蛋白（AFP）mRNA的系統(tǒng)比較研究，發(fā)現(xiàn)這一分子標(biāo)志在肝癌鑒別診斷和血道轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)方面比AFP蛋白更有優(yōu)越性。（5）應(yīng)用PCR、PCR-AFLP、PCR-RFLP、SSCP、DHPLC、DNA測(cè)序等研究技術(shù)，對(duì)男性不育、表皮松解性掌跖角化癥、注意缺陷多動(dòng)障礙等常染色體顯性遺傳病和多基因疾病進(jìn)行了疾病易感基因的尋找、基因突變譜的繪制、遺傳咨詢(xún)等研究工作；（6）新技術(shù)應(yīng)用于腫瘤微轉(zhuǎn)移、遺傳病的診斷中，產(chǎn)生了較大的社會(huì)效益。
3. 科學(xué)價(jià)值：先用陰性免疫磁珠去除絕大部分的白細(xì)胞，然后用陽(yáng)性免疫磁珠富集腫瘤細(xì)胞，最后用特異性高的定量RT-PCR分析腫瘤細(xì)胞特異的mRNA，建立了可靠而穩(wěn)定的分析外周血微量消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的方法。結(jié)合了免疫磁珠與RT-PCR兩者的優(yōu)點(diǎn)，使檢測(cè)的特異度和靈敏度均大大提高。優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的方法；同時(shí)克服了單獨(dú)使用RT-PCR具有一定假陽(yáng)性和假陰性的缺點(diǎn)。遺傳性疾病的研究中，不少方面的成果是國(guó)際首報(bào)，對(duì)探討幾種遺傳病的分子機(jī)制、分子診斷和產(chǎn)前診斷等，都具有一定的重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
4. 同行引用評(píng)價(jià)：被他人正面引用31次，其中SCI文章14篇。在4家醫(yī)療機(jī)制推廣應(yīng)用。
主要發(fā)現(xiàn)點(diǎn)： 1.聯(lián)用陰性和陽(yáng)性免疫磁珠及實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)外周血惡性腫瘤細(xì)胞方法的建立：先用CD45免疫磁珠去除絕大部分的白細(xì)胞，然后用上皮細(xì)胞特異的Ber-EP4免疫磁珠富集腫瘤細(xì)胞，最后用特異性高的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中的標(biāo)志mRNA，以確定血道中癌細(xì)胞的組織來(lái)源。本方法的特異度和靈敏度均高于國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的。（醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)；論文[1]、[2]）
2.以癌胚抗原（CEA）mRNA作為分子標(biāo)志，發(fā)現(xiàn)胃癌、結(jié)直腸癌血道轉(zhuǎn)移是一個(gè)較普遍的早期事件。以細(xì)胞角蛋白20（CK20）mRNA作為分子標(biāo)志，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌外周血癌細(xì)胞檢出率與腫瘤原發(fā)灶大小、淋巴結(jié)及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)。通過(guò)對(duì)肝癌、肝硬化和肝炎患者外周血中甲胎蛋白（AFP）mRNA的系統(tǒng)比較研究，發(fā)現(xiàn)AFP mRNA檢測(cè)在肝癌鑒別診斷和血道轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)方面比AFP蛋白檢測(cè)更具有優(yōu)越性。（醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)；論文[1]、[3]、[4]、[5]）
3.分析了我國(guó)表皮松解性掌跖角化癥家系的KRT 9基因突變，探討了基因突變與臨床表現(xiàn)的關(guān)系，在國(guó)際上首先發(fā)現(xiàn)1種新的突變，被國(guó)際中間纖維突變數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。通過(guò)對(duì)注意缺陷多動(dòng)障礙（ADHD）患者兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因的分析，發(fā)現(xiàn)漢族兒童注意缺陷多動(dòng)障礙患者的COMT基因 Val 158 Met多態(tài)性與ADHD無(wú)關(guān)聯(lián)，首次提出不能以COMT基因作為一個(gè)關(guān)聯(lián)因素應(yīng)用于A(yíng)DHD的臨床分子診斷。（分子遺傳學(xué)；論文[6]、[7]、[8]）
4.采用多重PCR的方法，對(duì)分布于A(yíng)ZF區(qū)與精子產(chǎn)生有關(guān)的3個(gè)區(qū)域內(nèi)的4個(gè)STS位點(diǎn)：sY86（位于A(yíng)ZFa亞區(qū)）、sY127（位于A(yíng)ZFb亞區(qū)）、sY254 和sY255（位于A(yíng)ZFc亞區(qū)）進(jìn)行缺失檢測(cè)，同時(shí)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)無(wú)精癥、少精癥患者中最易缺失的AZFc區(qū)DAZ基因在不同組織中的表達(dá)情況，并采用PCR-SSCP方法對(duì)DAZ基因內(nèi)橫跨1個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子的sY254位點(diǎn)的點(diǎn)突變進(jìn)行分析。首次證實(shí)部分漢族無(wú)精癥患者可能與AZFc的缺失有關(guān)。對(duì)精神分裂癥的分子診斷標(biāo)記研究中，針對(duì)國(guó)內(nèi)外十分關(guān)注的精神分裂癥可能的易感基因5-HTR2A，探討了其102T/C SNP在2個(gè)漢族群體精神分裂癥群體中的分布，初步否定了關(guān)聯(lián)性。針對(duì)1個(gè)少見(jiàn)的常染色體顯性遺傳Stargardt黃斑營(yíng)養(yǎng)不良-3樣家系，篩查了目前已知與STGD相關(guān)的3個(gè)候選基因ELOVL4、RDS和ABCR的突變信息，提示STGD3可能存在別的未知基因突變。論文發(fā)表于《Journal of Cellular and Molecular Medicine》，并被國(guó)際著名的"GeneCards"數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genecards.org/）列位該病研究的Top 10文獻(xiàn)。（分子遺傳學(xué)；論文[9]、[10]）
主要完成人： 1. 郭俊明
在本項(xiàng)目的第1、2發(fā)現(xiàn)點(diǎn)上做出了創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，建立了血液中微量消化系腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)方法。論文1-5、12的通訊作者，論文7、11、14的共同作者。本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的60%。
2. 張咸寧
在本項(xiàng)目的第3、4發(fā)現(xiàn)點(diǎn)上做出了創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，建立了分子遺傳學(xué)新檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用。論文6-8、10、13-17的通訊作者，論文9的共同作者。本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的60%。
3. 肖丙秀
在本項(xiàng)目的第1、2發(fā)現(xiàn)點(diǎn)上做出了創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，參與建立檢測(cè)腫瘤微轉(zhuǎn)移的新技術(shù)。論文1-5、11、12的共同作者。本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的55%。
4. 張新軍
在本項(xiàng)目的第2發(fā)現(xiàn)點(diǎn)上做出了創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，參與惡性腫瘤微轉(zhuǎn)移檢測(cè)新技術(shù)的研究和臨床應(yīng)用。論文1、4的共同作者，論文11的通訊作者。本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的35%。
5. 樂(lè)燕萍
在本項(xiàng)目的第3、4發(fā)現(xiàn)點(diǎn)上做出了創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，參與分子遺傳新技術(shù)的研究和應(yīng)用。論文6、8的共同作者。本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的35%。
10篇代表性論文： 1. Combined use of positive and negative immunomagnetic isolation followed by real-time RT-PCR for detection of the circulating tumor cells in patients with colorectal cancers/ Journal of Molecular Medic
2. 3種富集胃癌患者外周血中胃癌細(xì)胞方法的比較/世界華人消化雜志
3. 免疫磁珠與熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)在胃癌患者外周血癌細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值/中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志
4. Detection of cytokeratin 20 mRNA in the peripheral blood of patients with colorectal cancer by immunomagnetic beads enrichment and real time reverse transcriptase-polymeras chain reaction/ Journal of
5. Detecting AFP mRNA in peripheral blood of the patients with hepatocellular carcinoma, liver cirrhosis and hepatitis/Clinica Chimica Acta
6. A novel mutation of keratin 9 gene (R162P) in a Japanese family with epidermolytic palmoplantar keratoderma/ British Journal of Dermatology
7. An insertion-deletion mutation in keratin 9 in three Chinese families with epidermolytic palmoplantar keratoderma/ British Journal of Dermatology
8. 注意缺陷多動(dòng)障礙與兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因Vall58Met多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析/中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志
9. 無(wú)精癥、少精癥患者中AZF缺失的檢測(cè)/生殖與避孕
10. 102T/C SNP in the 5-hydroxytryptamine receptor 2A (HTR2A) gene and schizophrenia in two southern Han Chinese populations: Lack of association/ American Journal of Medical Genetics Part B-Neuropsychiat
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